测序 类似于罗氏454

工欲善其事，必先利其器，测序技术的进步使人类可以破解生命的密码，推动了基因组学的迅速发展，也是生命科学发展的强大推动力之一。

今天主要给大家介绍下DNA测序技术发展的前半生-也就是一代和二代测序技术的发展以及优缺点和应用方向。

图1.测序技术发展的里程碑[1]

一代测序技术

Sanger 测序是 DNA 测序技术的“金标准”，曾在人类基因组计划中发挥了关键推动作用，并且在现在仍被用来获得高度准确且可信赖的测序数据。

回顾1977年，当Frederic Sanger和他的同事开发出分子生物学史上第一个建立起来的DNA测序方法时，没有人可以想象接下来会发生什么（图1）。

同年Allan Maxam和Walter Gilbert提出了一种新的DNA测序方法，称为“化学降解法”，与Sanger测序法相比，化学降解法由于对待测DNA要求较高、操作繁琐、化学试剂毒性大等原因，没有成为主流测序技术，导致Sanger法在刚刚开始的新时代占据竞争优势。

Sanger和Maxam–Gilbert测序代表了第一代测序技术，引领市场30年，使大型基因组的解码成为可能，2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础[1]。

另外，中国科学院外籍院士吴瑞对Sanger法的雏形即引物延伸法做出了奠基性的贡献。

目前，基于一代测序技术的测序仪都是采用Sanger提出的链终止法。

创造性的将双脱氧核苷酸-ddNTP,作为链终止剂是其最重要的特点，ddNTP的2'和3'端均不含羟基，所以在核酸链合成过程中无法形成磷酸二酯键，导致DNA合成终止。

Sanger 法测序原理：

1.利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。

直到掺入一种链终止核苷酸为止。

2.每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

3.由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

4.它们具有共同的起始点，但在不同的的核苷酸上终止，通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段。

面对Sanger测序容易出现的样品测序无信号、信号差、信号衰减、测序中断或移码的现象，擎科生物不断地探索和优化 Sanger 测序技术，自主开发了“磁珠法测序平台”，以磁珠为依托的半自动测序流程代替传统膜纯化方法，大幅提高了生产效率及模板纯度和浓度，增加了测序成功率，有效避免了测序中容易出现的上述问题。

图2.擎科生物磁珠法测序平台

一代测序技术应用

1. PCR产物测序

对目的基因的PCR产物进行测序，获取目的基因序列；

2. 重测序

如克隆产物验证、SNPs、突变、插入、缺失等；

3. 分型分析菌分类学鉴定、HLA分型、病毒分型等；

4.临床应用

肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗，致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传病检测；

5.对新一代测序技术的结果进行验证。

优点：

1. 测序长度长，最长可达1000 bp；

2. 价格便宜，周期快，适合低通量样本的研究；

3. 仪器成本相对较低；

4. 对800 bp以内DNA序列上的碱基变异可以精准检测。

缺点：

1. 测序通量低，一个反应只能得到一条序列；

2. 单个反应成本低，获得大量序列的话成本高；

3. 难以检出高GC和重复序列区域；

4.不能检出大片段缺失和拷贝数变异等基因突变类型。

二代测序技术

大规模的平行测序始于2005年，随着罗氏454焦磷酸测序系统的推出，开启了下一代测序技术的新篇章，这种焦磷酸测序的方法能够以/高度并行的方式进行DNA测序，是第一项高通量技术。

2006年Illumina/Solexa推出了边合成边测序的GA测序仪。

2007年美国ABI公司推出了SOLiD系统。

Illumina和SOLiD测序器能产生更多的reads（分别为3000万和1亿 reads），但产生的reads只有35bp长。

2010年，Ion Torrent发布了个人基因组机器（PGM），这是一个采用半导体技术的系统。

第一个PGM能够产生大约270000 reads，平均长度为100 nt，不过由于原理简单、设计巧妙、体积小、操作方便、性价比高等优点已经成为桌面型测序仪的代表。

2013年华大基因收购美国Complete Genomics(CG)后推出BGISEQ-500测序系统[1]。

在经历了技术发展、市场兼并后，454、SOLID平台陆续退出竞争赛道，第二代测序仪逐渐形成了具有代表性的三大平台：基于边合成边测序原理的Illumina、Ion Torrent平台和基于边连接边测序原理的华大平台。

下面我们来看下这三个平台的测序原理：

1.Illumina 测序平台

Illumina测序平台是基于边合成边测序的原理，该技术在测序的过程中，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，因为dNTP的3'羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基，此时，用激光扫描反应板表面，根据dNTP所带的荧光读取每条模板序列每一轮反应所聚合上去的核苷酸种类，经过“合成-清洗-拍照”的循环过程，最终得到目的片段的碱基排列顺序。

2.Ion Torrent平台

Ion Torrent 测序平台的核心是一块创新的半导体芯片，采用非金属氧化物的半导体元件制成。

芯片上布满了小孔，就是一个个测序反应池，孔底部带有感应器。

ssDNA模板固定在ISP（Ion Sphere Particle,离子珠状颗粒）珠子上并以e-PCR扩增，每个反应池中可容纳一个ISP珠子，对应一个DNA分子即一条特定的DNA序列。

芯片置于一个离子敏感层和离子感受器上，以检测DNA合成链延长时释放出的氢离子信号。

整个一起主要由电子读取器、微处理器和流体系统组成，没有光学 组件。

无需光学检验和扫描系统，不需要激发光源、CCD成像仪或任何的荧光标记[2]。

3.华大的BGISEQ-500平台

BGISEQ-500是华大基因在cssDNA (circle single-strand DNA，环化单链 DNA)和 DNB (DNA Nano-Ball纳米球)等多个创新基础上研制的桌面型测序仪。

除了DNB与网格这一创新之外，CG的另一创新的概念是LFR(LongFragment Read，长片段读取序列)，不仅大幅度延长了下机序列的读长，而且可以区别父源或母源的单体型序列[2]。

单链DNA会缠绕成一个纳米球，纳米球可自动附着于有整齐的固定点的芯片上而不相互堆叠（即阵列技术），随后利用组合探针锚定连接法测序。

整个过程包含样本准备（形成末端修复的DNA片段）、片段扩增（加接头序列、形成单链DNA、成环、滚环扩增形成DNA纳米球）、纳米球附着于芯片并使用cPAS法测序[2]。

二代测序技术应用

1. 基因组de novo测序、转录组测序、重测序、扩增子测序、宏基因组测序、染色质免疫共沉淀测序、DNA甲基化测序等；

2. 在医学上的应用主要包括癌症基因组、遗传病基因组、肿瘤与代谢疾病等。

优点

1. 通量高，一次可对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定；

2. 单条序列成本低。

缺点：

1. 序列读长短；

2. 建库过程中有PCR过程，会引入错配碱基；

3. 要想得到准确和长度较长的拼接结果，需要较高的测序覆盖率，会增加成本和错误率。

下期介绍三代测序技术，敬请期待！

参考文献：

[1] Athanasopoulou K, Boti MA, Adamopoulos PG, Skourou PC, Scorilas A. Third-Generation Sequencing: The Spearhead towards the Radical Transformation of Modern Genomics. Life (Basel). 2021 Dec 26;12(1):30. doi: 10.3390/life12010030. PMID: 35054423; PMCID: PMC8780579.

[2] 杨焕明.《基因组学 2016》，科学出版社。

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